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Apr 26, 2024

메니스커스 효과를 보상하기 위한 적응형 위상차 현미경

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 5785(2023) 이 기사 인용 991 액세스 1 Altmetric Metrics 세부 정보 이 기사가 업데이트되었습니다. 위상차는 가장 중요한 것 중 하나입니다.

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 5785(2023) 이 기사 인용

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위상차는 투명하고 염색되지 않은 세포를 가시적으로 만드는 가장 중요한 현미경 방법 중 하나입니다. 세포 배양은 종종 여러 개의 원통형 웰로 구성된 미세역가 플레이트에서 배양됩니다. 배양 배지의 표면 장력은 웰 내에서 액체 렌즈를 형성하여 더 구부러진 가장자리 영역에서 위상차 조건이 실패하여 세포 관찰을 방해합니다. 적응형 위상차 현미경은 메니스커스 효과를 광학적으로 보상하여 관찰 가능한 영역을 크게 늘리는 방법입니다. 현미경의 콘덴서 고리는 투과형 LCD로 대체되어 동적 변화가 가능합니다. 변형 가능한 액체로 채워진 프리즘이 조명 경로에 배치됩니다. 프리즘의 표면 각도는 액체 렌즈의 접선 각도가 보상될 수 있도록 투과된 빛을 굴절시키기 위해 적응적으로 기울어집니다. 위상 대비 이미지 관찰 외에도 빔 스플리터를 사용하면 콘덴서 고리와 위상 링 변위를 동시에 볼 수 있습니다. 알고리즘은 변위를 분석하여 LCD와 프리즘을 동적으로 조정하여 위상차 조건을 보장합니다. 실험 결과, 특히 작은 우물 크기의 경우 관찰 가능한 영역이 크게 증가한 것으로 나타났습니다. 96웰 플레이트의 경우 표준 위상차 현미경 대신 위상차 조건에서 12배 이상의 면적을 검사할 수 있습니다.

1932년 Frits Zernike가 처음 제안한 위상차 현미경1은 투명하고 염색되지 않은 세포를 볼 수 있기 때문에 생물학적 시료를 관찰하는 데 널리 사용되는 방법입니다2. 간섭으로 인해 통과하는 빛의 위상 변화를 볼 수 있어 반투명 물체의 대비가 높아질 수 있습니다.

그러나 그 적용은 메니스커스 효과로 인해 제한되며, 이는 특히 96개 이상의 웰이 있는 마이크로플레이트의 샘플에 영향을 미칩니다3. 참조 측정에 따르면 6웰 플레이트에서 위상차 조건은 웰 표면적의 25%(950mm2 중 235mm2)에서 발견될 수 있습니다. 96웰 플레이트에서는 2.3%(36.3mm2 중 0.84mm2)4에 불과합니다.

위상차는 조명 빔 경로에 콘덴서 고리를 배치하고 대물렌즈의 빛을 위상 링을 통해 안내하는 투과광 현미경 방법입니다(그림 1 참조). 콘덴서 환형 이미지와 위상 링이 겹치면 위상 대비 조건이 발생합니다. 광학적으로 강조된 셀 경계와 같은 관찰된 표본의 전이에서 위상 변화가 발생합니다. 위상 대비 조건은 위상 변이 물체 주위에 어두운 배경과 밝은 가장자리가 있는 영역인 "후광" 효과로 쉽게 식별할 수 있습니다.

웰 위치가 서로 다른 위상차 현미경의 조명 경로를 도식적으로 표현한 것입니다. (A)현미경을 통한 단순화된 광 경로(편향 거울 및 유리판과 같은 비활성 요소는 생략되었습니다). (1) 광원 (2) 콘덴서 고리 (3) 콘덴서 렌즈 (5) MTP (6) 대물 렌즈 (7) 위상 링 (8) 이동식 거울 (9) 베르트랑 렌즈 (10) 접안 렌즈 (11) 보조 카메라 ( 12) 튜브렌즈(13) 메인 카메라. 거울(8)을 이동하면 주 광선 경로(I)와 보조 광선 경로(II) 사이를 전환하여 위상 고리와 집광기 환형 중첩을 관찰할 수 있습니다. (B) 빛이 우물 중앙을 통과한다. (B.1) 위상 링과 콘덴서 환형의 중첩 이미지. 그들은 완전히 겹칩니다. (B.2) 세포 배양의 위상차 이미지 결과. (C)우물 가장자리를 향한 표면의 곡률로 인해 광선이 중심에서 굴절됩니다. (C.1) 중첩 이미지에서 응축기 고리(2)와 위상 링(7) 사이의 편차가 표시됩니다. (C.2) 결과 셀 이미지는 명시야 조건에서 촬영됩니다. 이미지(A.2)와 (B.2)는 6웰 MTP에서 10x 대물렌즈(Nikon CFI Plan Fluor DL ​​10XF)를 사용하여 촬영되었습니다.