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Jun 05, 2024

틸트 미러 어셈블리를 사용하여 조정 가능한 주파수 조명을 갖춘 투과형 구조 조명 현미경

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 1453(2023) 이 기사 인용 2076 4 Altmetric Metrics 세부 정보 액세스 틸트 미러 보조 전송의 실험적 시연을 제시합니다.

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 1453(2023) 이 기사 인용

2076 액세스

4 알트메트릭

측정항목 세부정보

우리는 넓은 시야의 초해상도 이미징을 제공하는 틸트 미러 보조 투과 구조 조명 현미경(tSIM)의 실험적 시연을 제시합니다. 맞춤형으로 설계된 틸트 거울 어셈블리는 반대쪽 쌍의 거울면에서 반사된 두 광선의 간섭으로 샘플이 여기되는 조명 모듈로 사용됩니다. 거울-기울기 각도를 변경하여 조정 가능한 주파수 구조 패턴을 생성하고 세 가지 방향의 등방성 분해능을 위해 육각형 대칭 배열을 고려합니다. 표준 SIM의 높은 개구수(NA) 대물렌즈를 활용하면 시야(FOV)와 타협하는 초해상도를 제공합니다. 낮은 NA(20X/0.4) 대물렌즈 감지를 사용하여 \(\sim\)1.7- 및 \(\ sim\) 회절 한계에 비해 해상도가 2.4배 향상되었습니다(틸트 미러를 조정하여 다양한 조명 활용). 결과는 형광 비드와 생물학적 샘플 모두에 대해 검증되었습니다. tSIM 형상은 조명과 수집 광 경로를 분리하여 결과적으로 틸트 미러에 의해 정의된 조명 패턴의 공간 주파수에 영향을 주지 않고 이미징 대물 렌즈의 자유로운 변경을 가능하게 합니다. tSIM이 지원하는 크고 확장 가능한 FOV는 병리학에서와 같이 넓은 영역을 스캔해야 하는 애플리케이션과 공간과 시간 모두에서 이미지를 상호 연관시켜야 하는 애플리케이션에 사용할 수 있습니다.

지난 20년 동안 고전 형광 현미경의 회절 한계1,2를 깨뜨린 것은 생물 의학 연구에 혁명을 일으켰고 '광학 나노스코프'3,4라는 새로운 연구 분야로 이어졌습니다. 빠르게 발전하는 나노 현미경 분야에서 구조화 조명 현미경(SIM)5,6,7은 일련의 구조화된 패턴을 사용하여 형광 샘플을 자극하고 해당 원시 모아레 프레임을 계산적으로 처리하여 중요한 광시야 초해상도 기술로 나타납니다. 광시야 한계에 비해 약 2배의 해상도 향상을 달성합니다. 자극방출감소(STED),8,9 확률론적 광학 재구성 현미경(STORM),10,11 사진 활성화 국소화 현미경(PALM)과 같은 다른 광학 초해상도 기술에 비해 상대적으로 적당한 해상도 향상을 제공함에도 불구하고, SIM은 높은 시공간 해상도, 낮은 광독성, 일반적인 형광 라벨링과의 호환성, 효율적인 다색 이미징 등으로 인해 상당한 주목을 받았습니다. 또한 적은 수의 원시 프레임과 낮은 광자 선량이 요구되기 때문에 살아있는 세포18,19의 세포 내 역학 조사를 위한 유망한 접근 방식으로 간주됩니다. 정현파 구조의 여기 패턴은 SIM을 통해 우수한 해상도 이미징을 달성하는 핵심 기능이지만 더 이상 주기적인 조명 패턴으로 제한되지 않습니다. 블라인드 재구성 접근법을 사용한 반점형 무작위 조명도 SIM 이미징을 위해 성공적으로 구현되었습니다. 그러나 무작위 조명 방법은 많은 수의 프레임(\(\sim\)100s)이 필요하기 때문에 낮은 시간 해상도를 희생하면서 초해상도를 제공합니다. 이러한 방법은 2D(3D) SIM 사례에서 필요한 프레임 수(9(15))를 최소화하는 주기적인 구조 조명 이미징의 주요 주제를 제거하며 최근 보고된 특정 사례에서는 훨씬 더 적습니다. 따라서 잘 정의된 주기적인 조명 패턴을 유지하여 SIM의 해상도를 더욱 향상시키려는 노력은 가치가 있습니다.

기존의 선형 SIM 기술에서는 단일 대물렌즈를 사용하여 시료를 조명하고 형광 신호를 수집합니다. 결과적으로 조명과 감지 광학 장치는 모두 동일한 대물 렌즈에 의해 회절 제한되며 시스템은 기존 회절 한계에 비해 \(\le\) 2배 향상된 해상도를 제공하도록 엄격하게 제한됩니다. 일반적인 SIM 분해능 한계를 더욱 뛰어넘기 위해 TIRF(전면 반사 형광)-SIM24,25가 있는데, 여기서 소멸파의 고주파 간섭 패턴이 샘플을 조명합니다. 그러나 TIRF 조명은 얇은 광학 섹션(<100nm)으로 제한되므로 2D 이미징만 처리합니다. 게다가, 형광 물질의 포화 특성은 초고해상도 이미징에서 다중 고조파의 기여를 통합하는 비선형 SIM26,27,28 접근 방식에서 활용됩니다. 그러나 형광단의 작동 포화 수준에 도달하기 위한 높은 강도의 요구 사항은 비선형 접근 방식에 광독성 문제를 제공할 수 있습니다. 플라즈모닉29,30, 근접 투영 격자31 또는 광자 칩32와 같은 다양한 원리를 기반으로 하는 추가 SIM 기술도 보고되었습니다. 이러한 각 기술에는 샘플 평면에서 구조화된 조명 패턴을 조작하기 위한 정교하고 전용적인 광자 또는 플라즈몬 재료가 필요합니다. 또한 위상 변이 및 패턴 방향 변경을 위해 특별히 설계된 도구(예: 광자 칩 SIM용 열광학 또는 플라즈몬 SIM용 갈보 스캐닝)가 필요합니다. 일반적으로 이러한 기술은 전용 재료에 대한 의존성으로 인해 복잡합니다. 이는 조명 패턴 주파수의 조정 가능성을 제한합니다. 플라즈모닉 SIM에서는 사전 보정된 어레이 구조가 작동 파장 범위에 따라 제작됩니다. 특정 구조는 조명 패턴의 방향과 주파수를 선택적으로 결정하며 패턴의 조정 가능성은 없습니다. 마찬가지로, 광자 칩 SIM에서 조명 패턴 주파수는 사용 가능한 도파관 암의 각도에 따라 미리 결정됩니다. 마지막으로, 현미경 슬라이드나 커버슬립의 기존 샘플은 이러한 방법에 적합하지 않습니다. 소멸 영역에서 정재파 간섭 패턴에 의해 조명되는 설계된 재료의 표면에서 샘플을 준비해야 하며 이러한 기술은 2D-TIRF 초해상도로 제한됩니다.