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온전한 인간 거대세포바이러스 비리온의 공간적으로 분해된 단백질 지도

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온전한 인간 거대세포바이러스 비리온의 공간적으로 분해된 단백질 지도

Nature Microbiology 8권, 페이지 1732–1747(2023)이 기사 인용 2389 Accesses 80 Altmetric Metrics 세부 정보 헤르페스바이러스는 특성화하기 어려운 큰 외피 입자를 조립합니다.

자연 미생물학 8권, 1732~1747페이지(2023)이 기사 인용

2389 액세스

80 알트메트릭

측정항목 세부정보

헤르페스바이러스는 크기, 취약성 및 부분적으로 무정형인 복잡한 다층 프로테옴으로 인해 구조적으로 특성화하기 어려운 큰 외피 입자를 조립합니다. 여기서 우리는 가교 질량 분석법과 정량적 프로테오믹스를 사용하여 손상되지 않은 인간 거대 세포 바이러스 비리온의 공간적으로 해결된 상호 작용 맵을 파생했습니다. 이는 32개의 바이러스 단백질을 4개의 공간적으로 분해된 비리온 층으로 새롭게 할당하는 것을 가능하게 했으며, 각 층은 지배적인 바이러스 비계 단백질에 의해 구성되었습니다. 바이러스 단백질 UL32는 N-to-C-말단 방사형 방향으로 모든 층과 결합하여 뉴클레오캡시드를 바이러스 외피에 연결합니다. 우리는 82개의 숙주 단백질의 층별 결합을 관찰했으며 그 중 39개가 선택적으로 모집되었습니다. 우리는 PP-1 포스파타제를 동원하여 UL32가 어떻게 14-3-3 단백질에 대한 결합을 길항하는지 밝혀냈습니다. 이 메커니즘은 효과적인 바이러스 생물 발생을 보장하며, 이는 UL32-14-3-3 상호 작용의 혼란스러운 역할을 암시합니다. 마지막으로, 우리는 헤르페스비리온 내부의 바이러스 및 숙주 단백질 상호 작용의 기본 구성에 대한 글로벌 통찰력을 제공하기 위해 이러한 데이터를 대략적인 모델에 통합했습니다.

비리온이라고 불리는 감염성 입자의 구조화된 집합은 세포와 유기체 사이의 바이러스 전염에 기본입니다. 비리온은 캡시드 단백질 껍질에 둘러싸인 바이러스 핵산 게놈을 포함합니다. 함께 포장된 다수의 단백질은 감염 과정과 바이러스 유전자 발현의 시작을 촉진합니다. 이중 가닥 DNA 바이러스 계열인 헤르페스바이러스는 특히 크고 복잡한 입자를 조립하여 감염 시 숙주 세포로 전달되는 다양한 단백질을 수용합니다.

대규모 단백질 세트를 통합하는 헤르페스비리온의 능력은 전형적인 다층 구조에 의해 가능해집니다1. 외부 지질 외피에는 숙주 세포 수용체 결합 및 막 융합에 필요한 다양한 바이러스 당단백질이 들어 있습니다2. 외피와 중앙 정이십면체 뉴클레오캡시드 사이의 공간은 단백질성 기질인 외피로 채워져 있습니다. 개별 외피 단백질은 생화학적 및 현미경 데이터를 기반으로 별개의 내부 및 외부 하위층에 할당되었지만 외피 단백질 구성의 세부 사항은 이해되지 않습니다. 헤르페스바이러스 입자는 또한 수많은 숙주 단백질을 포함하지만 이러한 사건 중 극소수만이 기능적 또는 기계적으로 특성화되었습니다6,7.

헤르페스비리온에 대한 최근 극저온 전자 현미경(cryoEM) 연구를 통해 뉴클레오캡시드8,9, 포털10,11 및 여러 당단백질 복합체2,12,13의 하위 구조가 밝혀졌습니다. 또한 이전 연구에서는 헤르페스비리온의 전체 단백질 구성에 대한 통찰력만 제공하여 46~82개의 바이러스 단백질14,15,16,17,18을 식별했습니다. 그러나 비리온 내에서 바이러스와 숙주 단백질의 공간 조정 및 상호 작용에 대한 체계적인 특성 분석이 부족합니다.

여기서 우리는 가교 질량 분석기(XL-MS)를 사용하여 가장 큰 인간 헤르페스 바이러스인 인간 거대세포 바이러스(HCMV)의 손상되지 않은 세포외 비리온에서 32개의 바이러스 및 82개의 숙주 단백질의 비리온 전체 근접 맵을 구축합니다. 이 데이터를 통해 숙주 및 바이러스 단백질과 단백질-단백질 상호 작용(PPI)을 비리온 층에 새롭게 할당할 수 있어 외피 하위층의 구성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 우리는 바이러스 단백질 UL32(pp150이라고도 함)가 지배적인 비계 역할을 하고 입자 전반에 걸쳐 PPI에 참여하며 14-3-3 단백질 및 단백질 포스파타제 1(PP-1)과 같은 숙주 단백질의 모집을 중재한다는 것을 발견했습니다. . PP-1은 UL32에 대한 14-3-3 결합을 길항하며 바이러스 유전자 발현 및 바이러스 자손 생산의 효율적인 시작에 필요합니다. 따라서 기본 헤르페스비리온 내의 프로테옴 조직을 차트로 작성함으로써 중요한 PPI의 구조적, 기능적 이해를 위한 기초를 제공합니다.

0.75 in n = 2 biological replicates) in virions (bottom bar). d,e, Purified virions from recombinant mutant viruses harbouring alanine substitutions in the designated motifs were assessed for protein levels by immunoblotting. Representative experiments of n = 2 biological replicates are shown./p>91% of the protein copies inside a virus particle./p>10 copies) be identified in both replicates. When a crosslink involved a lower-abundance protein (that is, <10 copies), we required that the crosslink be identified in only one of the replicates. The rationale is that this balances crosslink confidence for highly abundant proteins with sensitivity for low-abundance proteins. Second, PPIs were only reported when there were two unique crosslinks identified, giving a higher-confidence set of PPIs. To retain only host proteins incorporated into the particle, host proteins that did not directly link to viral proteins were removed. The filtered set of crosslinks is available in Supplementary Table 2. The list of the corresponding PPIs together with evidence from existing data is available in Supplementary Table 3. The XL-based PPI network was generated on the basis of interprotein crosslinks from Supplementary Table 2 and visualized using edge-weighted spring-embedded layout70 in Cytoscape v.3.7.2. Edge weighting was based on the number of identified interlinks between protein pairs. Additional crosslink networks between selected proteins were visualized using xiNET71./p>0.75 were considered (from the Phospho (STY).txt table). The positions of individual phosphosites as identified from this experiment were used to map phosphosites on the UL32 amino acid sequence (Fig. 4c). Phosphosite SILAC ratios were also corrected for the protein-level SILAC ratios (from proteinGroups.txt) as quantified from an analysis of the whole-virion proteome without IMAC enrichment. Phosphosites were excluded when the corresponding phosphopeptide contained residues mutated in the SILK/RVxF motifs of UL32. Then, protein-level corrected phosphosite ratios were averaged (quantification in both replicates required)./p>0.6 were considered./p>

220 nm). These correspond to the median of diameters from the purified sample ± two times the standard deviation. The fraction of particles with diameters that fall below 160 nm, exceed 220 nm or fall in between are indicated for the non-cross-linked (d) or cross-linked (e) sample types. Purification results in more homogeneous particle diameters, enriching virions in the expected size range. Thus, our protocol captures the native configuration of the particles at relatively high sample purity. At least 367 particles were counted per condition./p>