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Jun 28, 2023

대체 바이러스 벡터 정제 기술 비교

작성자: Jack Vicalvi, J2 Biopharm Associates LLC 수석 과학자 이 글은 지난 15년 동안 개발되어 다음과 같은 혁신적 제품과 접근법에 대한 개요입니다.

작성자: Jack Vicalvi, J2 Biopharm Associates LLC 수석 과학자

이는 회수율과 순도가 더 높은 바이러스 벡터 치료제의 제조를 가능하게 하는 향상에 기여한 지난 15년 동안 개발된 엄선된 혁신적인 제품과 접근 방식에 대한 개요입니다.

이것은 몇 가지 특정 정화 기술 발전을 살펴보는 시리즈의 두 번째 부분입니다. 첫 번째 부분에서는 단일클론항체의 다운스트림 장비와 공정에 대해 논의했습니다.

2부에서는 이러한 제품이 바이러스 벡터 치료제 제조 방식을 어떻게 변화시킬 수 있는지, 현재 공정 개발 계획에서 사용될 수 있는지, 이전 방법에 비해 어떤 이점을 제공하는지 검토합니다. 우리는 이러한 혁신적인 제품이나 접근 방식의 사용을 촉진하는 상황 경제학을 다룹니다. 마지막으로 우리는 실용적인 목적을 위해 GMP 확장 모델에 중점을 둡니다. GMP로 확장되지 않으면 개발에서 얼마나 잘 작동하는지는 중요하지 않습니다.

바이러스 벡터 프로세스 흐름도

바이러스 벡터 수확물의 정화는 mAb 정화보다 더 복잡합니다. 전통적인 정화는 일반적으로 차등 또는 구배 원심분리로 시작됩니다. 원심분리기 버킷 배치 로드 크기가 일반적으로 작기 때문에(10~20L) 100L보다 큰 규모의 GMP 제조에서는 문제가 될 수 있습니다. 그런 다음 에어로졸 생성, 청소 및 검증 문제는 물론 눈에 띄지 않을 수 있는 자본 장비 비용도 있습니다. 원심분리 단계를 거치더라도 심도 여과와 멸균 여과는 여전히 필요합니다. 대부분의 바이러스는 음이온 전하 부분에 묶여 있기 때문에 바이러스에 따라 전하 심층 필터를 사용하는 것이 불가능할 수 있습니다. 그러나 200~300 mM NaCl이 존재하는 경우 이러한 장치로 많은 바이러스가 제거되지 않는 반면, 일부 HCP와 숙주 세포 DNA는 여전히 결합되어 있습니다.

렌티바이러스 및 알파바이러스와 같은 외피 바이러스는 더 불안정하며 심층 여과에 적합하지 않을 수 있습니다. 그러나 알파바이러스는 더욱 강력하며 정상적인, 심지어 전하를 띤 심층 여과가 가능할 수 있습니다. 이러한 경우에는 Pall SupraCap 100(4~2.1μm), Pall HCDII(1.2μm), AcroPak 500(0.8~0.45μm)을 직렬로 사용합니다. Millipore DOHC, COHC 및 XOHC 멤브레인도 사용할 수 있습니다. 0.2 µm 필터를 사용하면 일반적으로 상당한 손실이 발생하므로 최종 여과가 완료될 때까지 사용을 피해야 합니다. 처리 중에 무균 폐쇄 시스템을 유지하는 것이 필수적입니다.

아데노바이러스(AV) 및 아데노 관련 바이러스(AAV)와 같이 보다 널리 사용되는 비외피 바이러스는 180~250mM NaCl이 있는 상태에서 3M 전하 심층 필터를 사용하여 정화할 수 있습니다. 우리는 비외피 알파바이러스와 일부 외피 알파바이러스에 대해 05SP(10~2μm) 및 60SP(3~0.2μm) 필터를 직렬로 사용합니다.

바이러스 벡터 캡처의 전통적인 방법은 AIEX입니다. 이는 수지나 멤브레인을 사용하여 수행할 수 있습니다. 외피가 있는 바이러스의 경우 막 접근 방식이 포장된 기둥을 통과하는 구불구불한 경로보다 바이러스에 훨씬 더 온화하기 때문에 일반적으로 가장 좋습니다. 가장 일반적으로 사용되는 장치로는 Pall Mustang Q, Sartorius Sartobind Q-STIC 및 BIA CIMultus monolith가 있습니다. 멤브레인이나 모노리스의 가장 큰 단점은 용량이 낮아서 여러 사이클을 사용해야 한다는 것입니다. 그러나 베드 높이가 짧은(6~10cm) 컬럼을 사용하는 것도 효과적일 수 있으며, 멤브레인에 비해 용량이 크게 증가하는 추가 이점도 있습니다. 일반적으로 사용되는 비외피 바이러스는 수지나 막 장치로 포획할 수 있습니다.

또 다른 방법은 친화성 크로마토그래피를 사용하는 것입니다. 외피 바이러스를 포함하여 많은 바이러스는 표면에 헤파린 결합 부위를 가지고 있습니다. 우리는 M-SAN 뉴클레아제 분해 및 정화 후 알파바이러스의 포획 단계로 Heparin HyperD를 사용하여 성공했으며, 그 결과 컬럼을 450cm/hr로 실행하는 동안 hcDNA를 탁월하게 제거하고 HCP를 크게 감소시켜 90% 이상의 회수율을 달성했습니다. HyperD 세라믹 수지는 작동상 폴리스티렌 수지와 유사합니다. 초기 포획 단계로 Cellufine Sulfate 또는 Capto DeVirS를 통합한 다른 정제 프로토콜이 있습니다. 이 수지는 플라비바이러스 정제에 효과적이었습니다.